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張興/朱永群課題組Cell發文揭示細菌鞭毛馬達結構、組裝與扭矩傳輸機制

來源 : 基礎醫學(xue)系    發布時間 : 2021-04-21    瀏覽次數 : 1377
 

2021420日,加拿大pc張興教授實驗室和生命科學研究院朱永群教授實驗室合作在Cell雜志在線發表了題為“Structural Basis of Assembly and Torque Transmission of the Bacterial Flagellar Motor”的研究論文,解析了來源于病原菌沙門氏菌(Salmonella Typhimurium)的天然狀態下的鞭毛馬達-接頭裝置復合物(Flagellar motor-hook complex)的原子分辨率冷凍電鏡結構。該結構共含有12種不同的蛋白,共計175個亞基,總分子量超過6.3 MDa。該研究首次向人們展示了鞭毛馬達的不同組件包括聯動桿(rod)、外膜環(L ring)、周質環(P ring)、內膜環(MS ring)、分泌裝置(export apparatus)以及接頭裝置(hook)在內的高分辨率結構,首次系統地揭示了鞭毛馬達的組裝和扭矩傳輸機制。

1. 鞭毛馬達結構與工作機制的示意圖

細菌與其他生物具有漫長的生物共進化過程,這是一個相互斗智斗勇、趨利避害的競爭游戲。為了獲得豐富的營養物質、避免被追殺,以及為了成功找到適宜的生存和感染的位置,細菌進化出了快速“游動”的能力。1秒鐘可以跑出自己身長60倍、甚至100倍的距離,這是很多細菌具有的運動能力,遠超地球上跑得最快的動物獵豹。自1676年列文虎克通過自己設計的顯微鏡,首次觀察到能夠移動的細菌后,細菌運動能力及其機制引起了廣大的微生物學家、生物化學家、生物物理學家等研究人員的強烈興趣。

細菌具有這種運動能力是因為擁有獨特的運動器官—鞭毛。細菌鞭毛是一個巨大的納米機器,在結構上由細菌膜上的馬達(motor)、胞外的接頭裝置(hook)和鞭毛絲(filament)組成,橫跨細菌的內外膜,延伸到細菌細胞外。鞭毛馬達含有質子泵,通過轉運氫離子,將化學能轉變為機械能。鞭毛馬達旋轉并將扭矩傳輸給接頭裝置,然后傳給鞭毛絲,從而帶動鞭毛絲的轉動。鞭毛絲如同螺旋槳一樣,旋轉推動細菌向前移動。

細菌鞭毛馬達被認為是自然界中最高效、最精密的分子引擎,也是最復雜的蛋白質機器之一,能夠每秒鐘旋轉300-2400圈。由于其高度復雜性,鞭毛馬達一直是微生物學、生物化學、生物物理和結構生物學研究的難點。過去幾十年,科學家們對鞭毛馬達進行了大量的研究,包括預測組成成份、負染觀察結構、熒光檢測旋轉規律等,對鞭毛馬達進行了很多描述,然而其詳細結構、組裝機制和如何實現高效扭矩傳輸進而驅動鞭毛絲高速運轉的工作原理依然很不清楚,是領域內長期沒有解決的難題和挑戰。

該研究首先通過同源重組基因敲除的方法,將沙門氏菌基因組上編碼鞭毛絲蛋白FliC的基因和其帽子蛋白FliD的基因進行了敲除,排除鞭毛絲及其異質性和傳統的酸堿處理法對鞭毛馬達純化的影響。經過大量的嘗試,設計出了非常溫和的鞭毛馬達純化步驟,最終獲得了完整的、穩定的鞭毛馬達與接頭轉置復合物樣品,利用加拿大pc300千伏冷凍電鏡平臺,首先解析了整體鞭毛馬達-接頭復合物的3.9 Å結構,進而對不同部位進行local refinement,最終將聯動桿(rod)、外膜-周質環(LP ring)、內膜環(MS ring)、分泌裝置(export apparatus)以及接頭裝置(hook)的局部分辨率達依次達到3.2 Å2.8 Å3.6 Å3.2 Å3.4 Å

2. 鞭毛馬達總體結構

該研究有以下重要發現:

1)天然狀態下內膜環(MS ring)內部存在高度對稱錯位。內膜環是整個鞭毛馬達的組裝底座,它不僅可以旋轉,而且可以接受來自質子泵和胞質區環傳來的扭矩,并將扭矩傳給聯動桿(rod),而真實狀態下MS ring的對稱性長期以來具有爭議。文章首次證實了天然狀態下MS ring內部存在高度對稱錯位,其上部β-collar RBM3區具有C34的對稱性,底部RBM2區采取C23對稱性,而頂部伸出10個多肽鏈(5L1鏈和5L2鏈)。內膜環底部RBM2區緊緊地卡住分泌轉置,β-collar RBM3包圍分泌轉置和聯動桿下端。

2)分泌裝置(export apparatus)是聯動桿的組裝平臺,并決定了聯動桿的組裝方式。分泌裝置由5FliP亞基、1FliR亞基和4FliQ亞基組成。分泌裝置分泌各種鞭毛組裝蛋白,逐步地形成聯動桿,繼而形成細菌胞外的接頭裝置和鞭毛絲。研究發現,聯動桿通過下端FliEFlgBC端螺旋結構插入分泌裝置內腔中,打開并激活分泌裝置,而FliPFliR向上嵌入FliEFlgB之間的口袋里,FliPFliR相互結合方式決定了FliEFlgB的螺旋排列方式,而FliPFliRFliEFlgB之間的相互緊密結合促使分泌轉置和聯動桿在馬達工作時一同旋轉。

3. 內膜環結構及與聯動桿的相互作用

3) 聯動桿(rod)是由46個亞基組成、高度剛性的的螺旋桿狀結構。先前科學家們利用同位素標記、質譜等手段試圖分析rod的組成,但一直沒有明確結論,甚至部分推論相互矛盾。該研究顯示聯動桿是非常致密的螺旋桿狀結構,由5個蛋白、共46個亞基組成,其中遠端roddistal rod)是由24FlgG5FlgF組成,而近端rodproximal rod)是由6FlgC5FlgB6FliE組成。不同的rod蛋白具有相似的基礎特征,但各自具備特殊的結構特點。每個亞基跟周圍的亞基相互鎖定,保證了整個聯動桿高度的剛性,特別是FlgG蛋白的GSS區形成類似楔子的形狀,插入遠端rod表面的空隙中,極大地加強了rod的剛性,以保證rod的高速旋轉和高效的扭矩傳輸。

4)內膜環利用10條多肽鏈和FliEFlgB亞基向聯動桿傳輸扭矩,克服了馬達內部的結構不對稱性,實現了扭矩傳輸從水平到垂直方向的轉換。聯動桿通過近端的11個亞基(6FliE5FlgB亞基),延伸出6個小螺旋結構和5loop結構(環結構),牢牢地貼在內膜環的內表面上。反過來,內膜環伸出10條多肽鏈(5L15L2多肽鏈),緊緊地抓住聯動桿的中部。這種相互作用方式克服了內膜環圓盤結構和聯動桿的螺旋結構之間的結構不對稱性,實現了扭矩傳輸從水平方向到垂直方的轉換。多肽鏈與內膜環通過不規則的結構區連接,同樣連接6個小螺旋結構和5loop結構與聯動桿近端的也是不規則的結構區,這些不規則結構區既保證了柔性,又充當了履帶作用,從而將扭矩從內膜環傳到聯動桿上,然后致密的剛性聯動桿進一步將扭矩從近端往遠端傳輸。

5)外膜環(L ring)和周質環(P ring)彼此相互緊扣,形成獨特的桶狀結構。外膜環由26FlgH亞基組成,具有雙層β-桶結構,頂端的α螺旋水平排列形成外膜結合區,而26FlgH亞基進一步通過N端半胱氨酸上的脂肪基團錨定在外膜上。周質環由26FlgI單體組成,FlgI單體呈現“V”字形,由D1RBM1RBM2三個結構域組成。這三個結構域依次形成了周質環的上、外、下三個亞環結構,彼此相互作用。外膜環和周質環通過FlgHFlgI單體之間以“1 vs 4” 相互作用方式緊密結合,形成完整的、超穩定的C26對稱桶狀結構(簡稱外膜-周質環LP ring),即使在鞭毛解聚后,仍穩定地存在在外膜上。

4. 外膜-周質環結構及與聯動桿的相互作用

6)外膜-周質環使用靜電斥力和恒定氨基酸殘基形成的氫鍵環,確保了聯動桿高速旋轉時無摩擦和能量損耗。外膜環和周質環套在聯動桿的遠端,外膜環的內表面全帶負電,正好與也全帶負電的聯動桿遠端產生靜電互斥,大大地減小了外膜環與聯動桿之間的阻力,確保了聯動桿的高速旋轉。而周質環則圍繞聯動桿遠端,與之形成一個氫鍵相互作用環。在聯動桿遠端的參與這個氫鍵相互作用環形成的氨基酸殘基全部是固定的谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺等殘基,而在周質環上參與這個氫鍵環的殘基都是不變的賴氨酸和谷氨酰胺等殘基,因而在聯動桿旋轉時,周質環與聯動桿遠端之間的氫鍵重建不需要能量的損耗,所以這個氫鍵環如同軸承中的鋼珠球,既能保證聯動桿高速旋轉時不跑偏,而且不損耗扭矩傳輸中的能量。

7)聯動桿和胞外接頭裝置(hook)通過緊密的管狀結構相連,保證了聯動桿的扭矩全部傳輸給接頭裝置,進而帶動鞭毛絲的轉動。接頭裝置由蛋白FlgE組裝而成,FlgED0-DcD1D2結構域分別形成了接頭裝置的內、中、外三層管狀結構。接頭裝置的內管和中管插入到聯動桿遠端的兩層管中,通過疏水作用以及氫鍵相關交錯結合,將聯動桿和接頭裝置緊密地連接起來,保證聯動桿的扭矩全部傳輸給接頭裝置,而接頭裝置的外管在外側保護內管和中管的結構。由于FlgE單體的D0Dc結構域較短,且D2結構域相對獨立,接頭裝置具有一定的柔性,有利于聯動桿到鞭毛絲之間的柔性過渡,接頭裝置的外管結構通過電荷互斥和空間限制與外膜-周質環的靜電力作用一同精密地控制了聯動桿組裝長度。

細菌鞭毛是微生物學課本的基本內容,這項工作向人們揭開了鞭毛馬達的神秘面紗。鞭毛馬達通過獨特結構和各個結構元件之間精妙的相互配合,將質子泵轉化而來的機械能毫無損耗地迅速傳給鞭毛絲,促進鞭毛絲高速轉動,細菌得以快速運動。一位匿名評審專家說,這是一個里程牌的結構研究工作(represent a monumental structural effort)。另一位匿名評審專家表示,這是一件杰出的研究工作,它揭示了細菌鞭毛一些未知部分的無與倫比的高分辨率精細結構(This work is outstanding and gives unparalleled resolution on some of the least understood parts of the flagellum)。

細菌鞭毛馬達結構與機制的揭示是微生物領域內的一個重要突破,而且研究還發現鞭毛馬達的扭矩傳輸機制完全不同于自然界另一種分子馬達ATP合成酶,說明自然界分子馬達工作原理的多樣性,有利于更好地了解微觀世界的分子發動機。這項研究也為相關的合成生物學、生物物理學、納米機器人等研究奠定了堅實的基礎和提供了新的啟發。

朱永群教授和張興教授是本文的通訊作者,論文第一作者為朱永群實驗室研究生譚加興、博士后王小飛和張興教授實驗室研究生徐彩煌和張興教授,參加合作的還有生科院高海春教授實驗室和周艷研究員實驗室。該研究工作獲得了國家重點研發計劃、國家自然科學基金委、浙江省自然科學基金委、中央高校基本科研業務費專項資金以及國家高層次人才萬人計劃的資助和支持。

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